Полиморфный маркер ecNOS4a/4b гена эндотелиальной NO-синтетазы (NOS3)

Полиморфный участок 4a/4b расположен в интроне 4 и относится к тандемным повторам с изменяющимся числом копий (VNTR). Этот полиморфный маркер (ecNOS4a/4b) представлен двумя аллелями - аллелем 4а, в котором имеется 4 повторяющихся фрагмента, и аллелем 4b, в котором таких повторов 5. Для амплификации фрагмента ДНК, содержа­щего полиморфный маркер ecNOS4a/4b, использовали следующие праймеры:

NOS3-VNTR1 5'- aggccctatggtagtgccttt -3' и
NOS3-VNTR2 5'- tctcttagtgctgtggtcat -3'.

Амплификацию фрагмента гена NOS3, содержа­щего полиморфный минисател­лит­ный маркер ecNOS4a/4b, проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Трис-HCl, pH 8,8; 16,7 мМ сульфат аммония, 1,0 мМ хлорид магния, по 0,2 мМ каждого dNTP, 0,1%-ный твин-20, 10%-ный диметилсульфоксид, по 5 пикомо­лей каждого из праймеров, 50 - 100 нг геномной ДНК человека и 2 ед. полимеразы Taq (“Fermantas”, Литва). ПЦР проводили на термоциклере PHC-2 фирмы “Techne” (Велико­брита­ния) по программе: первый цикл - 940 C/3 мин, следующие 35 циклов - 940 C/1 мин, 600 C/1 мин, 720 C/1мин, последний цикл - 720 C - 6 мин. Идентификацию аллелей проводили после электрофорети­чес­кого разделения амп­лифицированных фрагментов ДНК в 2%-ном агароз­ном геле с последующей окраской бромистым этидием. Аллель 4a имеет длину 393 п.н. и аллель 4b - 420 п.н.

Полиморфный маркер (CCTTT)n гена индуцируемой NO-синтетазы (NOS2)

Для анализа ассоциации гена индуцируемой NO-синтетазы (NOS2), расположенного на хромосоме 17q11.2 использовали полиморфный маркер, содержащий пентануклеотидные повторы (CCTTT)n, расположенные внутри 5’-концевого промоторного региона данного гена.

Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего полиморфный маркер (СCTTТ)n, использовали следующие праймеры:
NOS2-5F 5’- tgccacccctggaagcctacaac -3’
NOS2-5R 5’- cgccactgcaccctagcctgtct -3’

Условия амплификации: 67 mM Tris-HCl (pH 8.8), 16.7 mM хлорид аммония, 3.0 mM хлорид магния, 0.1% твин 20, 10% диметил сульфоксид, 0.2 mM каждого dNTP, 5 pmol каждого праймера, 100 нг геномной ДНК и 2.5 единицы Tаg-полимеразы. ПЦР проводили на термоциклере PHC-2 фирмы “Techne” (Велико­брита­ния) по программе: денатурация – 20 сек. 940 С, отжиг – 30 сек. 630 С, элонгация – 30 сек. 720 С (35 циклов).

В результате амплификации получали 10 фрагментов ДНК длиной от 181 до 226 п.н., содержащих от 9 до 18 повторов. Фрагмент длиной 181 п.н. соответствует аллелю 9, а фрагмент длиной 226 п.н. – аллелю 18.

Полиморфный маркер вставка/отсутствие вставки (I/D) гена, кодирующего фермент, превращаю­щий ангиотензин I (ACE) Полиморфизм в интроне 16 гена ACE обусловлен наличием или отсутствием вставки мобильного элемента Alu, длина которого составляет 287 п.н. Ампли­фикацию данного фрагмента ДНК проводили с использованием следующих праймеров:

АСЕ1 5’- ctggagaccactcccatcctttct -3’
АСЕ2 5’- gatgtggccatcacattcgtcagat -3’.

Условия амплификации: 0,5 – 1,0 мМ хлорид магния, буфер для ДНК-полимеразы Taq. ПЦР проводили по следующей программе: предварительная денатурация – 94º С/4 мин, после чего проводили 35 циклов, включавших денатурацию – 94º С/1 мин, отжиг праймеров – 59º С /1 мин и синтез второй цепи – 72º С/1 мин.

Размеры амплифицированных фрагментов ДНК опреде­ля­ли после электро­фо­ре­ти­ческого разделения фрагментов в 1,5% агарозном геле. После ампли­фи­ка­ции получали или фрагмент длиной 490 п.н. (соответствует вставке, аллель I) или длиной 190 п.н. (соответствует отсутствию вставки, аллель D). В соответст­вии с наличием или отсутствием вставки субъекты были класси­фицированы как содержащие генотипы II (гомозиготы по аллелю I), DD (гомозиготы по аллелю D) и ID (гетерозиготы).